Сибирский федеральный университет

Тип публикации: отчёт о НИР

Год издания: 2017

Ключевые слова: биолюминесцентный анализ, почва, почвенный покров, оценка токсичности, ферментативные биотесты токсичности, экологический мониторинг, люцифераза, НАДН:ФМН-оксидоредуктаза, многокомпонентный иммобилизованный реагент

Аннотация: Настоящий проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы мониторинга окружающей среды, обеспечение экологической безопасности и приемлемого качества почв и почвенного покрова. Актуальность проекта связана, с необходимостью разрешения таких острых проблем как определение механизмов устойчивости и саморегуляции почвы на всех уровнях ее организации и использования, количественной диагностики состояния и поддержания плодородия и предотвращения деградации почвы, выбора высокоинформативных функциональных и фактологических оценочных критериев, имеющих экологическую и экономическую значимость, разработки системы научно обоснованных методов оздоровления деградированных и нарушенных почв. В подобной ситуации поиск интегральных характеристик оценки токсичности почв, позволяющих оценить последствия воздействия человека на эдафотоп, представляется актуальным. При этом следует констатировать отсутствие в мировой практике развитой методологии комплексного биотестирования почв, воды и воздуха как природных, так и искусственных экосистем. Вместо этого наблюдается тенденция к применению отдельных биотестов, что приводит к неадекватному отражению степени загрязнения окружающей среды и влиянию ее на человека. Предлагаемая в проекте «ферментативная функциональная модель живого организма» (ФМО) как комплексный биотест может помочь в решении обозначенной проблемы. Этот комплексный биотест сконструирован из набора ферментативных биотестов, в которых осуществляется связь «ключевые ферменты – функция организма». В сумме набор таких ключевых ферментов должен адекватно отражать влияние токсичной среды на жизнедеятельность организма в целом. В системе биотестов такой комплексный биотест необходим, так как он отражает влияние токсичной среды на молекулярном уровне.?Целью исследования является разработка новой методологии комплексной экспрессной оценки качества и загрязнения почвы на основе ферментов светящихся бактерий. ?Достигнутыми научными результатами работ по проекту за 2017 год являются: ??1. Была проведена оценка возможности использования биолюминесцентных ферментативных тестов в качестве диагностических показателей широкого спектра загрязняющих вещества на 68 модельных образцов почв, отобранных в экологически чистых районах. ?2. Для обеспечения экстракции из почв загрязнителей, имеющих разные физико-химические характеристики, была разработана модифицированная лабораторная методика пробоподготовки загрязненных почв с использованием разных растворителей, таких как дистиллированная вода, ацетон, этиловый спирт и ацетатно-аммонийный буфер. ?3. Предложенные варианты пробоподготовки были использованы для определения чувствительности биотеста, основанного на использовании биферментной системы NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза+люцифераза (R+L), к вытяжкам почвы, загрязненной солями тяжелых металлов (хлорида и сульфата меди, соединений свинца). Методом атомно-абсорбционной спектрометрии была подтверждена эффективность разработанного метода пробоподготовки почвы.?4. Определены условия хранения проб. Показано, что в сухом виде (воздушно-сухая проба) почвы могут храниться продолжительное время (более 14 месяцев) без изменения их физико-химических характеристик при условии отсутствия летучих соединений. Экстракты почв могут храниться в холодильнике при температуре +4°С в течение 3-5 дней. ?5. Проведенный спектральный анализ экстрактов модельных образцов почв показал наличие высокой корреляции содержания флуорофоров в почве с результатами биолюминесцентного биотестирования. ?6. Проведено исследование чувствительности ферментативных систем предлагаемого биотеста ФМО к растворам токсикантов в дистиллированной воде. Наибольшей чувствительностью к действию токсических веществ обладают моноферментная реакция, катализируемая бутирилхолинэстеразой, биферментная реакция R+L и триферментная реакция NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза+люцифераза (R+L) +лактатдегидрогеназа ( LDH+R+L).?7. Проведена оценка чувствительности ферментативных систем к воздействию токсических веществ при их внесении непосредственно в экстракты почв, что подтвердило возможность применения ФМО для экологического мониторинга загрязненных почв. ?8. Найдены условия по количеству реагентов, входящих в состав реакционной смеси для каждой ферментативной системы, обеспечивающие максимальную чувствительность комплексного теста ФМО (ферментативная модель организма).?9. Система биотестов ФМО показала хорошую воспроизводимость результатов (15-20 %), экспрессность проведения анализа (время пробоподготовки - 15-30 минут, процедура измерения - 3-10 минут) и высокую чувствительность методов на примере пестицида гексахлорана (ГХЦГ) и хлорида меди, внесенных непосредственно в образцы пяти эталонных почв. ?10. Проведено сравнение результатов ферментативного биотестирования (на примере биферментной системы NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза+ люцифераза) с результатами стандартизованных методов биотестирования, разрешенных к использованию в экологическом контроле. В 58% случаев биолюминесцентный метод выявил токсичность образца (сильное ингибирование), не обнаруженную с помощью известных методов.?11. Для различных типов экосистем почвы проведено математическое моделирование распределения гумусовых и органических веществ в почве с усреднёнными в масштабах биомов вертикальными распределениями в почвенном профиле. Показаны тренд и изменения содержания гумусовых веществ в агропочвах под залежами. Установлены математические зависимости между количеством гумуса, подвижных гумусовых веществ в агропочвах залежей разного возраста и климатом. Разработанные модели имеют фундаментальную и практическую значимость.?12. Проведены регрессионные исследования между параметрами загрязненной почвы и результатами биолюминесцентного тестирования с использованием биферментной системы NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза+ люцифераза, которые показали сложные взаимосвязи между свойствами почвы, степенью загрязнения и величиной остаточного свечения биолюминесцентной ферментативной тест-системы.?13. Разработана схема базы данных исследования почвенных образцов с управляющей моделью изучения почвенных образцов для Платформы консолидации данных научных исследований. Предложенное информационное решение по организации данных исследования почвенных образцов реализует возможность структурированного хранения данных, создавая основу для сопоставления результатов смежным исследований, аналитической обработки данных и развития предложенной базы данных, сообразно выбранному направлению научных изысканий. База данных необходима для инвентаризации и классификации изученных многочисленных образцов почвы, отличающихся характеристиками.?14. Показана возможность адаптация ферментативных методов биотестирования под существующие портативные приборы без потери чувствительности методов, на примере биолюминометра «LumiShot+» производства ООО «НПП «Прикладные биосистемы» (Красноярск) с целью создания Портативной лаборатории для мониторинга загрязнения почвы, включающей прибор-биолюминометр, реагенты и новые методики.?15. На основе проведенных экспериментальных исследований по анализу чувствительности ферментативных систем к разным классам токсических веществ и с учетом корректировки приемов конструирования ферментативных методов тестирования, для дальнейших исследований в комплексную систему тестов рекомендуется включить: моноферментную реакцию, катализируемую бутирилхолинэстеразой, биферментную систему R+L и триферментную систему LDH+R+L.?16. Ссылки на информационные ресурсы в сети Интернет (url-адреса), посвященные проекту:?http://рнф.рф/ru/node/2550 ?http://kras.mk.ru/articles/2017/10/13/mkekologiya-krasnoyarskiy-kray.html?http://gazeta.sfu-kras.ru/node/5379 ?http://www.sfu-kras.ru/staff/19347 ?https://sib.fm/news/2017/09/27/uchjonye-nashli-sposob-opredeljat-toksichnost-nanomaterialov?http://fano.gov.ru/ru/press-center/card/?id_4=38815?http://www.sbras.info/news/sibirskie-uchenye-predlozhili-ispolzovat-svetyashchiesya-molekuly-dlya-opredeleniya-toksichnost?http://krsk.sibnovosti.ru/science/356641-krasnoyarskie-uchenye-nauchilis-opredelyat-toksichnost-nanomaterialov? http://news-w.com/64556-6952/? http://www.krskstate.ru/press/news/0/news/85768? https://glasnarod.ru/nauka/125427-krasnoyarskie-uchenye-razrabotali-biolyuminesczentnuyu-test-sistemu-dlya-opredeleniya-toksichnosti-nanomaterialov?http://www.sib-science.info/ru/news/sibirskie-uchenye-predlozhili-27092017? http://www.24rus.ru/more.php?UID=147949? http://mirtesen.sputnik.ru/blog/43632873495/Krasnoyarskie-uchenyie-sozdali-biolyuminestsentnuyu-fermentativn?

• Кратасюк Валентина Александровна

• РИНЦ (eLIBRARY.RU)