Сибирский федеральный университет

Тип публикации: статья из журнала

Год издания: 2021

Идентификатор DOI: 10.17650/1818-8346-2021-16-2-48-55

Ключевые слова: Ph-myeloproliferative neoplasm, CALR, Heteroduplex analysis, sanger sequencing, Ph-миелопролиферативное новообразование, ген CALR, гетеродуплексный анализ, секвенирование по Сэнгеру

Аннотация: Введение. В соответствии с клиническими рекомендациями Всемирной организации здравоохранения анализ соматических мутаций в гене CALR, как и мутаций в генах JAK2 и MPL, включен в перечень критериев диагностики Ph-миелопролиферативных новообразований.В гене CALR выявлено более 50 различных вариантов мутаций, среди которых наиболее распространенными являются делеция 52 (c.1092_1143del) и вставка 5 пар оснований (c.1154_1155insTTGTC) (88 %). Оставшиеся 12 % включают другие варианты делеций/вставок или их комбинаций, которые либо уникальны, либо обнаружены у небольшого числа пациентов.Удобнее всего для выявления одновременно всех возможных вариантов мутаций CALR использовать методы секвенирования. Также актуально предварительное проведение дешевого скринингового теста, позволяющего выявить любые мутации в анализируемом фрагменте ДНК. Таким методом может стать гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ).Цель работы - разработать, клинически апробировать и продемонстрировать возможность использования метода гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ для выявления мутаций в экзоне 9 гена CALR в качестве скринингового теста.Материалы и методы. Для проведения скринингового исследования соматических мутаций в гене CALR методом гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ использовали образцы ДНК от 13 пациентов с различными фенотипическими вариантами Ph-миелопролиферативных новообразований и предварительно выявленными мутациями CALR. Для наиболее распространенных вариантов мутаций CALR (c.1092_1143del и c.1154_1155insTTGTC) был проанализирован порог определения доли мутантного аллеля. Нуклеотидную последовательность фрагмента экзона 9 гена CALR определяли с помощью cеквенирования по Сэнгеру. Также для оценки уровня аллельной нагрузки все 13 образцов были проанализированы с помощью метода пиросеквенирования.Результаты. Метод гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ позволил выявить мутации в экзоне 9 гена CALR у всех 13 пациентов. Порог определения доли мутантного аллеля для мутации c.1154_1155insTTGTC составил от 6,25 % аллельной нагрузки, для мутации c.1092_1143del - от 3,13 %.Заключение. Метод гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ подходит для скрининга любых вариантов делеций/вставок или их комбинаций в гене CALR. По наличию гетеродуплексов можно заключить о наличии мутации, даже если мутантный продукт не визуализируется в геле (в случае небольших мутаций). Background. In accordance with the World health organization clinical guidelines, the analysis of somatic mutations in the CALR gene, as well as mutations in the JAK2 and MPL genes, are included in the list of criteria for the Ph-myeloproliferative neoplasms diagnosis.More than 50 different mutation variants have been found in the CALR gene, among which the most frequent are a 52 bp deletion (c.1092_1143del), also called type 1, and a 5 bp insertion (c.1154_1155insTTGTC), also called type 2 (88 %).The remaining 12 % are other type less frequent indels or combinations thereof.It is most convenient to use sequencing methods to identify all possible variants of CALR mutations. It is also important to develop inexpensive screening test that can detect any mutations in the analyzed DNA fragment of CALR gene. This method can be heteroduplex analysis followed by electrophoresis on polyacrylamide gel (PAGE).The objective: to develop and demonstrate the feasibility of using heteroduplex analysis with separation of the PCR product by electrophoresis on non-denaturing PAGE for the CALR exon 9 mutations detection as the screening test. Materials and methods. DNA samples of 13 CALR-positive patients with different phenotypic variants of Ph-myeloproliferative neoplasms were screened by heteroduplex analysis. For the most common variants of CALR mutations (c.1092_1143del and c.1154_1155insTTGTC), a threshold determination of the mutant allele presence was analyzed.Nucleotide sequence of exon 9 fragment was determined using Sanger sequencing. Also, all 13 samples were analyzed using the pyrosequencing method to assess the allelic burden level.Results. Heteroduplex analysis revealed mutations in exon 9 of the CALR gene in all 13 patients. The threshold determinations of the method in the case of the c.1154_1155insTTGTC and c.1092_1143del analysis are 6.25 % and 3.13 % of the mutant allele presence in the patient sample, respectively.Conclusion. The proposed variant of the heteroduplex analysis with separation of the PCR product by electrophoresis on non-denaturing PAGE can be recommended for use as the preliminary screening test which is carried out before the confirming sequencing methods for the different indels (or combinations thereof) CALR mutations determine.The presence of heteroduplexes indicates the presence of a mutation, even if the mutant product is not visualized (in case of small mutations). Background. In accordance with the World health organization clinical guidelines, the analysis of somatic mutations in the CALR gene, as well as mutations in the JAK2 and MPL genes, are included in the list of criteria for the Ph-myeloproliferative neoplasms diagnosis. More than 50 different mutation variants have been found in the CALR gene, among which the most frequent are a 52 bp deletion (c.10921143del), also called type 1, and a 5 bp insertion (c.11541155insTTGTC), also called type 2 (88 %). The remaining 12 % are other type less frequent indels or combinations thereof. It is most convenient to use sequencing methods to identify all possible variants of CALR mutations. It is also important to develop inexpensive screening test that can detect any mutations in the analyzed DNA fragment of CALR gene. This method can be heteroduplex analysis followed by electrophoresis on polyacrylamide gel (PAGE). The objective: To develop and demonstrate the feasibility of using heteroduplex analysis with separation of the PCR product by electrophoresis on non-denaturing PAGE for the CALR exon 9 mutations detection as the screening test. Materials and methods. DNA samples of 13 CALR-positive patients with different phenotypic variants of Ph-myeloproliferative neoplasms were screened by heteroduplex analysis. For the most common variants of CALR mutations (c.10921143del and c.11541155insTTGTC), a threshold determination of the mutant allele presence was analyzed. Nucleotide sequence of exon 9 fragment was determined using Sanger sequencing. Also, all 13 samples were analyzed using the pyrosequencing method to assess the allelic burden level. Results. Heteroduplex analysis revealed mutations in exon 9 of the CALR gene in all 13 patients. The threshold determinations of the method in the case of the c.11541155insTTGTC and c.10921143del analysis are 6.25 % and 3.13 % of the mutant allele presence in the patient sample, respectively. Conclusion. The proposed variant of the heteroduplex analysis with separation of the PCR product by electrophoresis on non-denaturing PAGE can be recommended for use as the preliminary screening test which is carried out before the confirming sequencing methods for the different indels (or combinations thereof) CALR mutations determine. The presence of heteroduplexes indicates the presence of a mutation, even if the mutant product is not visualized (in case of small mutations). © 2021 ABV-Press Publishing House. All rights reserved.

Журнал: Онкогематология

Выпуск журнала: Т. 16, № 2

Номера страниц: 48-55

ISSN журнала: 18188346

Место издания: Москва

Издатель: ООО "Издательский дом "АБВ-пресс"

• Субботина Т. Н. (2ФГБУ «Федеральный Сибирский научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства России»; Сибирский федеральный университет)
• Курочкин Д. В. (ФГАОУ ВО «Сибирский федеральный университет»)
• Маслюкова И. Е. (ФГАОУ ВО «Сибирский федеральный университет»)
• Хазиева А. С. (КГБУЗ «Краевая клиническая больница»)
• Васильев Е. В. (КГБУЗ «Краевая клиническая больница»)
• Михалёв М. А. (КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница № 7»)
• Дунаева Е. А. (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора)
• Миронов К. О. (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора)

• РИНЦ (eLIBRARY.RU)
• Scopus
• Список ВАК