Сибирский федеральный университет

Перевод названия: The protein moiety function in chemical bonds' energy conversion into light by Ca2+- activated luciferases

Тип публикации: отчёт о НИР

Год издания: 1998

Аннотация: Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получены мутантные варианты обелина с заменой аспарагиновой и глутаминовой кислот на аланин и глицин соответственно в 11 и 12 положениях в I, II, III, I+II, I+III, II+III, I+II+III Ca2+-связывающих доменах обелина. Для мутантных вариантов обелина исследована кинетика люминесцентного ответа и определена чувствительность к ионам кальция. Проведенные аминокислотные замены вызывают изменения: а) чувствительности мутантных вариантов обелина к кальцию; б) наклона кривой зависимости интенсивности люминесценции от концентрации кальция; в) кинетики люминесцентного сигнала. Mg2+ в концентрации 10 мМ, как правило, уменьшает амплитуду люминесцентного ответа и изменяет его характер, а также сдвигает кривую зависимости интенсивности люминесценции от [Ca2+] в область более высоких концентраций кальция. Используя диэтилпирокарбонат (DEPC) для селективной модификации гистидина, определено количество "доступных" аминокислотных остатков в молекуле апообелина и фотопротеиновом комплексе: апообелин-целентеразин- О2, а также исследовано влияние этих модификаций на способность апобелка образовывать активный комплекс и на способность фотопротеинового комплекса к люминесценции. Из пяти гистидиновых остатков обелина в апобелке DEPC модифицируется только один. После модификации апобелок практически полностью теряет способность к образованию фотопротеинового комплекса. Образование активного комплекса апообелин-целентеразин-О2, т.е. связывание субстратов с белком, защищает от модификации гистидиновый остаток. При помощи ДТНБ определено количество свободных SH-групп: а) в молекуле апообелина в отсутствие Ca2+; б) когда Са2+-связывающие домены апообелина насыщены Ca2+; в) в молекуле обелина, связанного с целентеразином. Во всех трех состояниях из пяти цистеиновых остатков в свободном состоянии находится один, но скорость модификации SH-группы зависит от состояния, в котором находится фотопротеин. Наибольшая скорость модификации наблюдается для апообелина в отсутствие Са2+, наименьшая - для обелина связанного с целентеразином. После модификации SH-группы апообелин полностью теряет способность связывать целентеразин, которая частично восстанавливается при добавлении избытка дитиотреитола. Модификация SH-группы обелина, связанного с целентеразином, вызывает люминесценцию фотопротеина. With a method of site-directed mutagenesis applied, the obelin mutants were obtained, with alanine and glycine in place of aspartate and glutamate acids correspondingly in positions 11 and 12 in the I, II, III, I+II, I+III, II+III, and I+II+III Ca2+-binding obelin domains. For the obelin mutants the kinetics of the luminescent response was studied and the sensitivity to calcium ions was determined. The performed amino acid replacements initiate the changes in: a) a sensitivity of the obelin mutants to calcium; b) the slope of the calcium concentration-effect curve; c) the kinetics of the luminescent response. As usual, the 10 mM Mg2+ decreases the amplitude of the luminescent response and changes the character of the one. It also results in a shift of calcium concentration-effect curve to the higher calcium concentrations. With a diethylpyrocarbonate (DEPC) used for a selective modification of histidine, the amount of the "available" amino acid residues in apoobelin molecule and in a photoprotein complex (apoobelin-coelenterazine-O2) was determined, as well as the effect of these modifications on the ability of apoprotein to form an active complex and on the capability of the photoprotein complex for luminescence was studied. Out of 5 histidine obelin residues there is only one that is modified in the apoprotein with DEPC. As modification is over, the apoprotein practically completely loses its ability to form a photoprotein complex. The formation of an active complex apoobelin-coelenterazine-O2, i.e. binding of the substrates to a protein, protects a histidine residue from modification. Through the use of DTNB the number of the free SH-groups was determined: a) in the apoobelin molecule in the absence of Ca2+; b) under saturation of Ca2+-binding apoobelin domains with Ca2+; and c) in the molecule of obelin bound to coelenterazine. In all three states there is only one cystein residue out of five that is in a free state, but the rate of the SH-group modification depends on the state of a photoprotein. The greatest modification rate is observed in apoobelin in the absence of Ca2+, the lowest rate - in the obelin bound to coelenterazine. After the SH-group modification the apoobelin loses its ability to bind coelenterazine completely, this ability partially restores on the addition of the excess dithiotreitol. Modification of the SH-group of obelin bound to coelenterazine, initiates the photoprotein luminescence.

• Высоцкий Е.С. (Институт биофизики СО РАН (ИБФ СО РАН))

• РИНЦ (eLIBRARY.RU)